Desde 1531 hasta 1533 Juan de Ávila estuvo procesado por la Inquisición. Las acusaciones eran muy graves en aquellos tiempos: llamaba mártires a los quemados por herejes, cerraba el cielo a los ricos, no explicaba correctamente el misterio de la Eucaristía, la Virgen había tenido pecado venial, tergiversaba en sentido de la Escritura, era mejor dar limosna que fundar capellanías, la oración mental era mejor que la oración vocal... Todo menos la verdadera acusación: aquel clérigo no les dejaba vivir tranquilos en su cristianismo o en su vida ‘clerical’. Y Juan fue a la cárcel donde pasó un año entero.
Juan de Ávila no quiso defenderse y la situación era tan grave que le advirtieron que estaba en las manos de Dios, lo que indicaba la imposibilidad de salvación; a lo que respondió: <<No puede estar en mejores manos>>. San Juan fue respondiendo uno a uno todos los cargos, con la mayor sinceridad, claridad y humildad, y un profundo amor a la Iglesia y a su verdad. Y aquél que no quiso tachar a los cinco testigos acusadores, se encontró con que la Providencia le proporción 55 que declararon a su favor.
Este tiempo en la cárcel produjo sus frutos interiores, al igual que lo hiciera con san Juan de la Cruz. En ella escribió un proyecto del Audi, Filia, pero sobre todo, como él nos cuenta, allí aprendió, más que en sus estudios teológicos y vida anterior, el misterio de Cristo. Juan fue absuelto. Pero lo que más humillante fue la sentencia de absolución: “Haber proferido en sus sermones y fuera de ellos algunas proposiciones que no parecieron bien sonantes”, y le mandan, bajo excomunión, que las declare convenientemente, donde las haya predicado.